想精准诱导RAW264.7成为促炎的M1“战士”或抗炎的M2“修复者”？别找了！这份保姆级、超详细的RAW264.7细胞M1/M2极化方案，从试剂配比到操作细节，一次性打包给你！
01 必备材料清单
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细胞：RAW264.7小鼠单核巨噬细胞系
注意：传代次数不宜过多，建议<10代
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培养基：高糖DMEM
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血清：胎牛血清(FBS)，推荐使用10%
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抗生素：青霉素-链霉素双抗溶液(1%)
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关键诱导剂：
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溶剂对照：PBS或细胞培养基（用于溶解冻干诱导剂的溶剂）
注意：所有细胞因子、LPS建议分装后-20℃或-80℃保存，避免反复冻融！使用前务必在冰上或4℃缓慢溶解，并用预冷的培养基或PBS稀释至工作浓度。
02 实战操作步骤[1,2] (以6孔板为例)
- 消化处于对数生长期的RAW264.7细胞，用含10%FBS和1%双抗的完全DMEM培养基制成单细胞悬液。
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（关键步骤）将细胞以2~3x105cells/孔的密度接种于6孔板中，每孔加入2mL完全培养基
注意：密度过低影响状态，过高可能导致接触抑制或自发分化
- 放入37℃，5%CO2培养箱中孵育过夜（约16-24小时），让细胞充分贴壁。
- 确认细胞贴壁良好，约60-70%汇合度为最佳诱导窗口期。
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小心吸弃孔内旧培养基。
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(可选步骤)：加入1-2mL预热的PBS，轻轻洗涤细胞表面。
注意：此步可去除残留血清及代谢废物
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更换极化培养基：
M1组：每孔加入2mL含100ng/mL的LPS+20ng/mL的IFN-γ的完全培养基。
M2组（M2a为例）：每孔加入2mL含20ng/mL的IL-4和20ng/mL的IL-13（可选项）的完全培养基。
对照组1-未处理：只加2mL新鲜完全培养基
对照组2-溶剂对照：加入含有诱导剂等体积溶剂的完全培养基。（排除溶剂本身的影响）
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37℃,5%CO2条件下继续培养。
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24小时是最常用且效果显著的标准时间点。
注意：根据具体实验目的(如检测早期/晚期基因、蛋白分泌)，可调整至6、12、48或72小时，但需预实验验证。
诱导后24小时，可以通过以下方法验证极化表型：
Western Blot/ELISA（蛋白提取）：加入适量预冷的RIPA裂解液（含蛋白酶/磷酸酶抑制剂)，冰上裂解，收集裂解液。
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Western Blot：检测iNOS，Arg1，CD206等关键蛋白表达水平
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ELISA：检测上清液中TNF-α，IL-6(M1)，CCL17，CCL22 (M2a) 等细胞因子的分泌水平
流式细胞术：用不含EDTA的胰酶消化（轻柔，时间不宜过长）或细胞刮收集细胞，用预冷的PBS（含1-2%FBS）洗涤1-2次，重悬于适量缓冲液中染色。
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M1表面标志物：CD86，MHC-II等表达上调。
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M2表面标志物：CD206，CD163等表达上调。
免疫荧光：在孔板内进行固定、通透和染色操作。
图1 采用免疫荧光染色法对 RAW264.7
巨噬细胞M1/M2 表型标志物进行检测
细胞形态（辅助观察）：M1细胞常变得更圆、更亮、伪足减少；M2细胞则可能变得更拉长、铺展、类似“煎蛋”状。但这只是辅助观察，不能作为单一判定标准
注意：通常需要结合至少两种方法（如qPCR+流式）来综合判断极化是否成功且特异。
03 成功关键事项
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诱导剂活性：细胞因子和LPS活性会随时间下降。小量分装，避免反复冻融，注意有效期。 -
细胞密度：60-70%汇合度是诱导的黄金标准。密度过高细胞易衰老，过低则反应不足。 -
设置对照：未处理组和溶剂对照组可帮你排除基础表达和溶剂效应。 -
操作轻柔：换液、洗涤时动作要轻，避免把贴壁不牢的细胞冲掉。 -
时间一致性：确保所有处理组在同一时间点收获细胞，减少时间变量带来的误差。
近岸蛋白可提供科研级IFN gamma，IL-4，IL-10，IL-13等细胞因子产品，高活性，低内毒素，助力体外巨噬细胞培养。
RAW264.7来源巨噬细胞培养因子
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目录号 |
产品名称 |
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C746（引用文献50+） |
Recombinant Mouse IFN gamma |
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CK15（引用文献70+） |
Recombinant Mouse IL-4 |
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C697（引用文献5+） |
Recombinant Mouse IL-10 |
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CH18（引用文献5+） |
Recombinant Mouse IL-13 |
Recombinant Mouse IFN gamma （Cat#C746）
Determined by its ability to inhibit the proliferation of murine WEHI-279 cells. The expected ED50 is 1 ng/ml.
Recombinant Mouse IL-4 (Cat#CK15)
Measured in a cell proliferation assay using NFS60 mouse myelogenous leukemia lymphoblast cells.The ED50 for this effect is 182 pg/mL.
参考文献
[1]Kimbrough D, Wang SH, Wright LH, et al. HDAC inhibition helps post-MI healing by modulating macrophage polarization. J Mol Cell Cardiol. 2018;119:51-63. doi:10.1016/j.yjmcc.2018.04.011
[2]Li P, Hao Z, Wu J, et al. Comparative Proteomic Analysis of Polarized Human THP-1 and Mouse RAW264.7 Macrophages. Front Immunol. 2021;12:700009. Published 2021 Jun 29. doi:10.3389/fimmu.2021.700009